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草莓果实单糖转运体重要基因挖掘、克隆与功能验证

作者: 园艺作物省重点实验室 日期:2016-05-10 17:32:35 浏览次数:2199

单糖转运体是草莓糖代谢过程中的重要载体。由园艺作物省实验室伊兴凯博士主持的国家青年自然科学基金(青年基金)项目草莓果实单糖转运体亚细胞定位对果实风味品质的影响2014-2016年),以丰香和红颜草莓为试材,以拟南芥单糖转运体为模板,通过与草莓基因组进行同源性比对,获得13条疑似单糖(果糖)转运体基因。经基因家族进化树分析、实时荧光定量PCRqRT-PCR)时空表达和跨膜结构分析,最终筛选出g-31477g-203552可能的单糖(果糖)转运体候选基因。

将筛选且克隆的g-31477连接至酵母表达载体pNEV-N上,将pNEV-N-31477电转酵母。结果表明,含有糖转运蛋白基因的质粒可将培养基中的单糖(果糖、葡萄糖和甘露糖、半乳糖)转运给酵母菌,并使其成活。为此,筛选克隆的基因g-31477具有单糖(果糖)转运的活性。

以红颜草莓cDNA为模板,克隆得到基因g-31477的全长。通过KpnIXbaI位点将该基因成功连入载体pCAMBia2300,并转化至根癌农杆菌GV3101。实验采取瞬时表达的方式,将转化后的农杆菌GV3101适时注射到草莓果实中。HPLC检测表明,与对照相比实验处理果实中的单糖有明显的提升,其中果糖提高了3.82%、木糖提高了2.07%、葡萄糖提高了1.22%、半乳糖提高了3.55%、甘露糖提高了3.07%

实验设置了不同抗生素类型、浓度和配方,不同培养基类型,不同培养方式,培养基的选择方式,共培养时间等组合方式,以筛选和建立高效的草莓转化体系。阶段性实验结果表明,外植体接种于再生培养基中,采用暗培养的方式,在25±2℃环境下,培养72 h;外植体转移再生频率可高达4.23%,转基因植株材料及分析正在进行之中。

来源于:园艺作物省重点实验室
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